Das Projekt “µ-Viroscreen – ein neuer mikrofluidischer Ansatz für die Quantifizierung infektiöser Viren” wurde vom 1. Juli 2021 bis zum 31. Dezember 2023 in Zusammenarbeit zwischen dem Institut für Bioprozess- und Analysemesstechnik (iba) in Heiligenstadt und der Technischen Hochschule Mittelhessen (THM) in Gießen unter der Schirmherrschaft des Bundesministeriums für Bildung und Forschung (BMWK) über den Advanced Innovation Fund (AiF) durchgeführt. Das Forschungskonsortium DECHEMA koordinierte das Projekt, wobei sich die beiden Institute die Verantwortung teilten: Die iba konzentrierte sich auf das Design, die Herstellung und die Automatisierung der mikrofluidischen Plattform, während die THM ihre Expertise in den Bereichen Virologie, Durchflusszytometrie und quantitative PCR (qPCR) einbrachte und die biologische Validierung der Assays übernahm.
Das wissenschaftliche Hauptziel bestand darin, einen konventionellen Virusquantifizierungstest in ein automatisiertes mikrofluidisches System zu übertragen und zu zeigen, dass dieser Ansatz den Zeitaufwand für den Nachweis infektiöser Baculoviren (BV) im Vergleich zu Standardmethoden wie dem TCID50 reduzieren kann. Es wurden zwei Baculovirus-Genotypen verwendet: ein Wildtyp AcMNPV und eine GFP-exprimierende Variante (AcMNPV-GFP). Sf-9-Insektenzellen wurden in serumfreiem Medium infiziert, und virale DNA wurde für die qPCR-Kalibrierung extrahiert. Der qPCR-Assay erreichte einen zehnfachen Anstieg des Virustiters von 1,0 × 10⁶ auf 1,0 × 10⁷ Kopien mL-¹, mit einem linearen Kalibrierungsbereich von 1,1 × 10⁷ bis 1,1 × 10² Genomkopien mL-¹. Der Korrelationskoeffizient betrug R² = 0,995 und die Amplifikationseffizienz lag bei 1,04, was auf eine ausgezeichnete Reproduzierbarkeit hindeutet; die Variation bei den Wiederholungen lag unter 0,6 CT (weniger als 3 %). Diese Daten lieferten eine robuste Referenz für die mikrofluidischen Messungen.
Für die Durchflusszytometrie optimierte das Team den Nachweis infizierter Zellen durch Messung der GFP-Fluoreszenz für das GFP-Virus und durch Anfärbung des Oberflächenproteins gp64 mit einem Anti-Gp64-Antikörper für das Wildtyp-Virus. Der Assay erforderte eine Inkubation über Nacht für den GFP-Nachweis, während die gp64-Färbung innerhalb von Minuten nachgewiesen werden konnte. Für beide Nachweismethoden wurde eine lineare Kalibrierungskurve erstellt. Versuche, die virale mRNA durch Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung zu quantifizieren, waren nicht reproduzierbar und erwiesen sich als zu kostspielig und zeitaufwendig, so dass dieser Ansatz nicht weiter verfolgt wurde.
Die mikrofluidische Plattform integrierte modulare fluidische Mikrosysteme (FMS) für die Tröpfchenerzeugung, die Virusinjektion, die Inkubation und die anschließende Analyse. Das Droplet-in-Droplet-Design ermöglichte den Transport von fluoreszenzmarkierten Kompartimenten ohne Tenside, was eine direkte Kopplung mit einem Durchflusszytometer ermöglichte. Das System ermöglichte den Nachweis von viralen Oberflächenproteinen nach nur 5 Stunden Inkubation, was eine erhebliche Reduzierung im Vergleich zu herkömmlichen TCID50-Assays bedeutet, die mehrere Tage benötigen. Die GFP-basierte Detektion im mikrofluidischen Modus benötigte bis zu 20 Stunden und entsprach damit der Zeit, die für den Offline-Assay benötigt wurde. Wichtig ist, dass Injektionstests bestätigten, dass die Plattform eine Kreuzkontamination zwischen den Tröpfchen verhinderte und damit die Robustheit des Assays sicherstellte.
Insgesamt hat das Projekt gezeigt, dass ein automatisierter mikrofluidischer Arbeitsablauf einen schnellen, quantitativen Nachweis infektiöser Baculoviren mit Leistungskennzahlen ermöglichen kann, die mit etablierten qPCR- und Durchflusszytometriemethoden vergleichbar sind. Die von der DECHEMA unterstützte und vom BMWK finanzierte Zusammenarbeit zwischen iba und THM hat das erklärte Ziel, eine µ-Viroscreen-Plattform zu entwickeln, die die Zeitspanne der Virusquantifizierung verkürzt und die Prozessanalytik für die biopharmazeutische Produktion verbessert, erfolgreich erreicht.